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人類(lèi)基因組編碼的所有蛋白質(zhì)中，其中30%是膜蛋白并且膜蛋白占藥物靶點(diǎn)的60%以上[1]。膜蛋白廣泛存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞器上，是生命活動(dòng)的核心調(diào)控者[2]。膜蛋白失調(diào)會(huì)引發(fā)多種疾病，所以膜蛋白成為許多藥物開(kāi)發(fā)的靶點(diǎn)[2]。
一、膜蛋白主要承擔(dān)以下幾類(lèi)功能
物質(zhì)運(yùn)輸功能：比如離子通道、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等，膜蛋白是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機(jī)制。
信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)：受體類(lèi)蛋白（比如GPCR）負(fù)責(zé)接收細(xì)胞外信號(hào)并向細(xì)胞內(nèi)傳遞，GPCR是上市藥物目標(biāo)中占比最高的一類(lèi)[1-2]。
細(xì)胞識(shí)別與粘附：膜蛋白可以介導(dǎo)免疫識(shí)別、細(xì)胞間連接和組織分布[1]。
酶活性以及結(jié)構(gòu)支撐功能：膜蛋白自身具有酶功能同時(shí)會(huì)參與維持細(xì)胞骨架連接、膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[4]。
圖1：七次跨膜（7TM）受體信號(hào)傳導(dǎo)
Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002
二、膜蛋白合成遇到的挑戰(zhàn)
膜蛋白因疏水性、多跨膜結(jié)構(gòu)域以及折疊復(fù)雜度，被認(rèn)為是最難表達(dá)的一類(lèi)蛋白，其結(jié)構(gòu)解析是結(jié)構(gòu)生物學(xué)長(zhǎng)期面臨的核心難題。
1、在細(xì)胞體系中表達(dá)成功率低
由于跨膜結(jié)構(gòu)域有很強(qiáng)的疏水性，所以在細(xì)胞內(nèi)容易導(dǎo)致蛋白錯(cuò)誤折疊或者聚集。而且許多膜蛋白對(duì)細(xì)胞有毒性，會(huì)直接導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[5]。所以會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)膜蛋白在細(xì)胞體系內(nèi)難以高效表達(dá)。
2、正確的構(gòu)象依賴(lài)磷脂雙分子層
大多數(shù)膜蛋白只有依賴(lài)天然的膜結(jié)構(gòu)才能正確折疊，但是傳統(tǒng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)難以精準(zhǔn)提供這些環(huán)境[6]。
3、去垢劑篩選困難，純化成本較高
不同膜蛋白對(duì)去垢劑的偏好不同，需要大量實(shí)驗(yàn)篩選，并且純化過(guò)程中容易破壞折疊狀態(tài)[5]。
4、穩(wěn)定性差、純度低
膜蛋白穩(wěn)定性差，聚集性強(qiáng)，是結(jié)構(gòu)研究的最大瓶頸之一。
三、無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)：膜蛋白研究的破局點(diǎn)
無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)( CFPS)可以在體外環(huán)境中直接合成蛋白質(zhì)，具備開(kāi)放性、無(wú)毒性限制等特點(diǎn)，被認(rèn)為是解決膜蛋白表達(dá)難題的關(guān)鍵技術(shù)之一。
無(wú)細(xì)胞毒性
無(wú)細(xì)胞表達(dá)技術(shù)不涉及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，所以不受細(xì)胞毒性的影響，可以表達(dá)對(duì)宿主有毒性的通道蛋白或者跨膜蛋白。
2、可添加去垢劑、納米盤(pán)等輔助折疊
可以合成接近天然膜的折疊環(huán)境，顯著提升膜蛋白的表達(dá)量、成功率和功能活性。
3、開(kāi)放性體系、可控性高
4、可實(shí)現(xiàn)快速構(gòu)建和篩選
適合突變體篩選和高通量蛋白功能篩選平臺(tái)。
圖2：無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)與傳統(tǒng)系統(tǒng)流程圖
四、珀羅汀無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)為膜蛋白突破性研究助力
珀羅汀生物基于自主開(kāi)發(fā)的無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)體系，已構(gòu)建了從試劑盒到一站式膜蛋白表達(dá)服務(wù)的產(chǎn)品體系。通過(guò)在表達(dá)反應(yīng)中引入納米盤(pán)、去垢劑等折疊輔助因子，能夠有效提升多跨膜受體、轉(zhuǎn)運(yùn)體、離子通道等難表達(dá)膜蛋白的可溶性與功能性獲得。公司已在多種膜蛋白項(xiàng)目中實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)研究級(jí)別的表達(dá)量與活性，顯著縮短科研客戶(hù)從“基因 → 功能蛋白"的研發(fā)周期。
未來(lái)，隨著納米盤(pán)輔助折疊、非天然氨基酸標(biāo)記、自動(dòng)化高通量篩選等技術(shù)持續(xù)迭代，珀羅汀無(wú)細(xì)胞平臺(tái)將進(jìn)一步擴(kuò)大在膜蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)、抗體藥物發(fā)現(xiàn)、新靶點(diǎn)驗(yàn)證等方向的應(yīng)用范圍，為科研與藥物研發(fā)提供更高成功率、更短周期、更高確定性的膜蛋白解決方案。
[1] Overington JP, Al-Lazikani B, Hopkins AL. How many drug targets are there?. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):993-996.
[2] Venkatakrishnan AJ, Deupi X, Lebon G, Tate CG, Schertler GF, Babu MM. Molecular signatures of G-protein-coupled receptors. Nature. 2013;494(7436):185-194.
[3] Pierce KL, Premont RT, Lefkowitz RJ. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3(9):639-650.
[4] White SH, Wimley WC. Membrane protein folding and stability: physical principles. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1999;28:319-365.
[5] Seddon AM, Curnow P, Booth PJ. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 2004;1666(1-2):105-117.
[6] Corradi V, Mendez-Villuendas E, Ingólfsson HI, et al. Lipid-Protein Interactions Are Unique Fingerprints for Membrane Proteins. ACS Cent Sci. 2018;4(6):709-717.
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