mRNA展示(mRNA display)技術是一種基于基因型-表型偶聯原理的超高通量蛋白篩選技術，能夠在體外實現對萬億級規模蛋白或多肽分子庫的功能篩選。然而，傳統依賴細胞表達體系的蛋白篩選方法受到細胞轉化效率、蛋白毒性、表達容量以及復雜蛋白折疊限制，難以滿足現代蛋白工程和藥物發現對于超大規模分子多樣性的需求。

無細胞蛋白表達技術(cell-free protein synthesis, CFPS)通過在體外重構翻譯過程，為mRNA展示提供了更加開放、高效和可調控的平臺環境，使研究人員能夠直接連接序列設計、蛋白表達和功能篩選過程。近年來，隨著無細胞表達體系、核糖體展示以及mRNA展示技術的發展，研究人員進一步將CFPS與蛋白定向進化結合，實現了超大規模蛋白庫構建和功能篩選。最新研究表明，cell-free display技術正在成為蛋白工程和人工蛋白設計的重要工具。

1. mRNA展示技術的發展與基本原理

mRNA展示技術最早由Roberts和Szostak于1997年提出，其核心思想是利用嘌呤霉素(puromycin)作為連接分子，在翻譯過程中實現新生肽鏈與編碼mRNA之間的共價連接，從而形成穩定的mRNA-protein融合分子[1,2]。

由于蛋白質功能信息與遺傳信息被物理連接，研究人員可以首先利用功能篩選方法富集具有目標性質的蛋白分子，例如高親和力結合蛋白，然后通過PCR擴增對應mRNA序列，實現連續多輪體外定向進化。

隨后，大規模體外篩選技術不斷發展，研究人員利用mRNA展示體系實現了針對蛋白結合能力的高通量篩選，使其成為繼噬菌體展示之后的重要蛋白工程平臺[5]。

圖1：mRNA展示技術原理

(來源:https://doi.org/10.3389/fchem.2020.00447)

2. 無細胞蛋白表達體系為何成為mRNA展示的重要支撐技術?

傳統蛋白表達主要依賴細胞系統，例如大腸桿菌、酵母以及哺乳動物細胞。然而，對于mRNA展示而言，細胞體系存在天然限制。

首先，細胞轉化效率限制了文庫規模。即使采用高效電轉方法，單次實驗能夠覆蓋的突變庫規模通常在10?–10?范圍，而mRNA展示理論上可以達到1013級別。這意味著大量潛在功能蛋白無法通過傳統細胞篩選方式被探索。

其次，細胞環境對于蛋白表達存在嚴格限制。例如部分膜蛋白、毒性蛋白以及復雜折疊蛋白在宿主細胞中表達困難，而無細胞體系可以通過調節反應環境，包括氧化還原狀態、分子伴侶以及膜模擬體系，實現對困難蛋白的表達支持。

與傳統細胞表達相比，無細胞基因表達體系避免了細胞存活和代謝限制，可以直接調控反應體系中的DNA、RNA、核糖體以及能量模塊，因此能夠支持快速原型驗證、高通量篩選以及復雜蛋白表達等應用場景[4]

圖2：無細胞表達體系的應用

(來源：https://doi.org/10.1038/s43586-021-00046-x)

3. CFPS體系如何提升mRNA展示性能?

mRNA展示的核心要求是：高效率蛋白翻譯;穩定的mRNA-protein偶聯;蛋白正確折疊;保持篩選過程中蛋白功能。

傳統細胞裂解型CFPS體系雖然具有較高蛋白產量，但由于包含大量細胞組分，可能存在核酸酶、蛋白酶以及代謝背景干擾。

近年來，PURE系統(Protein synthesis Using Recombinant Elements)通過純化核糖體、翻譯因子和能量系統，實現了更加精準可控的體外蛋白合成環境。

Shimizu等人在2001年建立PURE系統，通過重構37種純化因子，實現了定義條件下的蛋白表達，為后續mRNA展示和蛋白工程研究提供了重要基礎[3]。

4. 無細胞表達技術推動困難蛋白和膜蛋白發現

在藥物研發領域，大量關鍵靶點屬于傳統表達體系難以處理的蛋白，例如GPCR、離子通道以及跨膜蛋白。

膜蛋白約占人類蛋白組20%以上，同時也是超過50%的藥物作用靶點。然而，由于疏水結構和復雜折疊需求，其表達一直是蛋白工程領域的重要挑戰。

無細胞表達體系可以通過加入：去垢劑(detergent)、脂質體、納米盤(nanodisc)，模擬天然膜環境，提高膜蛋白表達和功能保持。

圖3：無細胞膜蛋白表達策略

(來源：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072272)

5. 珀羅汀生物(PLD Technology)：面向蛋白發現的新一代無細胞表達平臺

隨著mRNA展示、蛋白定向進化以及AI蛋白設計的發展，科研人員對于無細胞表達平臺的需求已經從“能否表達蛋白"轉向：是否能夠快速獲得具有正確結構和功能的蛋白分子。

蘇州珀羅汀生物(PLD Technology)專注于無細胞蛋白表達技術開發，為蛋白工程、藥物發現以及復雜蛋白研究提供技術支持。

基于自主優化的CFPS體系，珀羅汀平臺針對傳統表達體系中的關鍵痛點進行優化，包括：

√ 高效率蛋白表達;

√ 二硫鍵蛋白折疊環境優化;

√ 膜蛋白表達體系開發;

√ 蛋白功能驗證與篩選支持。

特別是在mRNA展示等高通量蛋白篩選場景中，高質量無細胞表達體系能夠幫助研究人員縮短從序列庫構建到功能評價的研發周期，提高蛋白發現效率。

參考文獻

[1] Roberts RW, Szostak JW. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. PNAS. 1997;94:12297-12302.

[2] Nemoto N, Miyamoto-Sato E, Husimi Y, Yanagawa H. In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett. 1997 Sep 8;414(2):405-8.

[3] Shimizu Y, et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 2001;19:751-755.

[4] Silverman AD, Karim AS, Jewett MC. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 2020;21:151-170.

[5] Wilson DS, Szostak JW; New Collective Author. In vitro selection of functional nucleic acids. Annu Rev Biochem. 1999;68:611-47.